黃曲霉毒素B1檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)使用說明書：

1、原理及用途：

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、飼料等樣本中的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的黃曲霉毒素B1和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素B1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素B1含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。

2、黃曲霉毒素B1檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)：

2.1、試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2、反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3、檢測下限：

谷物…………………………………………0.15ppb

玉米皮、麩皮等吸水性強樣本……………0.6ppb

食用油、花生油……………………………0.6ppb

醬類、餅干、糕點等食品或調(diào)料…………0.6ppb

啤酒…………………………………………0.3ppb

葡萄酒、醬油、醋…………………………0.15ppb

茶葉…………………………………………0.2ppb

麥類…………………………………………1.2ppb

2.4、交叉反應(yīng)率：

黃曲霉毒素B1…………………………100%

2.5、樣本回收率：

谷物…………………………………85±15%

花生油………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

醬類、餅干、糕點等食品或調(diào)料…83±15%

啤酒…………………………………84±15%

葡萄酒、醬油、醋…………………87±15%

茶葉、麥類…………………………75±15%

3、試劑盒組成：

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液(黑蓋)：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb…………………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………5.5ml

抗體工作液(藍蓋)………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

說明書………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4、需要的器材和試劑：

4.1、儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2、微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3、試劑：甲醇、正己烷、3氯甲烷

5、樣本前處理：

5.1、樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果

5.2、配液：

配液1：樣本提取液

70%甲醇，即V甲醇：V去離子水=7：3

配液2：工作洗滌液

將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)

配液3：樣本復(fù)溶液

35%甲醇，即V甲醇：V去離子水=3.5：6.5

5.3、樣本前處理步驟：

5.3.1、谷物處理方法：

1)稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加5ml樣本提取液(配液1)，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻

3)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：5檢測下限：0.15ppb

5.3.2、玉米皮、麥麩等吸水性強樣本處理方法：

1)稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml樣本提取液(配液1)，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；(對于毒素含量的樣本可用樣本復(fù)溶液(配液3)稀釋后再測。比如取2)中的混合液0.1ml加0.9ml樣本復(fù)溶液(配液3)混勻，最終樣本稀釋倍數(shù)為200，檢測下限為6ppb。)

3)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：20檢測下限：0.6ppb

注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時需多點取樣充分混勻后再取2g進行試驗

5.3.3、食用油、花生油處理方法：

1)稱取2ml樣本于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣本提取液(配液1)，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)去除上層液體，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水，混勻，再取混勻液體0.5ml加入0.5ml樣本復(fù)溶液(配液3)，振蕩30s

3)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：20檢測下限：0.6ppb

5.3.4、醬類、餅干、糕點等食品或調(diào)料處理方法：

1)稱取1g±0.05g粉碎樣本至15ml離心管中，加10ml甲醇，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘

2)取2ml上清至15ml離心管中，于50℃-60℃下氮氣或空氣吹干

3)加入2ml去離子水，振蕩30s，再加入6ml3氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘

4)取下層3氯甲烷液1.5ml至10ml離心管，于50℃-60℃下氮氣或空氣吹干

5)加入0.5ml正己烷，振蕩30s，再加入1ml樣本復(fù)溶液(配液3)，振蕩1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘

6)去除上層有機物相，取下層清液50µl分析

樣本稀釋倍數(shù)：20倍檢測下限：0.6ppb

5.3.5、啤酒處理方法：

1)將啤酒充分?jǐn)嚢?去除二氧化碳)，取2ml啤酒樣本，加入1ml蒸餾水，再加入7ml甲醇，振蕩5分鐘

2)取混勻后的樣本液0.5ml加入0.5ml去離子水，混勻

3)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：10檢測下限：0.3ppb

5.3.6、葡萄酒、醬油、醋處理方法：

1)取2ml樣本，加入2ml蒸餾水，再加入10ml3氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取下層液體1ml于50-60℃下氮氣或空氣下吹干

3)加入0.5ml樣本提取液(配液1)充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水，混勻

4)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：5檢測下限：0.15ppb

5.3.7、茶葉處理方法：

1)稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加4ml甲醇溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取0.3ml上清，加入0.6ml去離子水，混勻

3)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：6檢測下限：0.2ppb

5.3.8、麥類處理方法：

1)稱取1g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加入2ml樣本提取液(配液1)，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取0.2ml上清，加入0.2ml去離子水，振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘

3)取離心后的樣本液0.1ml加入0.9ml樣本復(fù)溶液(配液3)，混勻

4)取50µl進行分析

樣本稀釋倍數(shù)：40檢測下限：1.2ppb

6、酶聯(lián)免疫試驗步驟：

將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上，洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃

6.1、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置

6.2、加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘

6.3、洗滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350µl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干(用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)

6.4、顯色：每孔加入底物液A50µl，再加底物液B50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘(若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間)

6.5、終止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)

6.6、測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成

7、結(jié)果分析：

7.1、百分吸光率的計算：

標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%)=A×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算：

以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析(歡迎來電索取)

8、注意事項：

8.1、室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低

8.2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作

8.3、混合要均勻，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性

8.4、在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射

8.5、不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑

8.6、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm<0.5)時，表示試劑可能變質(zhì)

8.7、反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚

9、貯藏及保存期：

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保質(zhì)期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。